获得铁死亡敏感性或逃逸死亡？细胞中这种醚脂发挥了重要作用

背景

铁死亡(Ferroptosis)是2012年Dixon等在研究erastin杀死含有致癌基因RAS突变肿瘤细胞的作用机制时发现的一种铁依赖的氧化损伤引起的新型细胞死亡方式^[1]。这种细胞死亡方式在形态学上与凋亡、坏死和自噬都有较大差别。目前认为铁死亡过程主要为细胞膜脂上的多聚不饱和脂肪( polyunsaturated fatty acid，PUFA) 链可被脂氧合酶( lipoxygenase，LOXs) 和ROS 等氧化，形成脂质过氧化物( lipid hydroperoxide，L-OOH)。在铁存在下，脂质过氧化物转变成有毒的脂质自由基( LO^-)，导致细胞膜脂的多聚不饱和脂肪酸破碎，引发细胞死亡^[2]。铁死亡作为一种应激反应已经在多种病理状态下被观察到，包括神经退行性疾病、缺血再灌注损伤、铁代谢相关疾病及肿瘤等^[3]。近年来研究发现不同细胞对铁死亡的敏感性不同，且细胞对铁死亡的敏感性可以随着细胞状态的变化而改变，这种动态变化对设计开发靶向铁死亡药物有着重要意义^[4]，但是细胞如何调节对铁死亡的敏感性目前尚不清楚。

2020年9月16日，来自哈佛大学Broad研究所的Stuart L. Schreiber教授、邹贻龙博士以及来自Whitehead生物医学研究所的Robert A. Weinberg教授合作在Nature上发表题为：Plasticity of ether lipids promotes ferroptosis susceptibility and evasion 的文章。他们通过全基因组CRISPR-Cas9筛选、脂质组学等方法，探索了肾癌和卵巢癌细胞对铁死亡敏感和逃逸的分子机制，发现过氧化物酶体中合成的一类多不饱和醚磷脂（缩醛磷脂）是调控铁死亡敏感性的关键因素，并且在心肌细胞和神经细胞分化中也发现缩醛磷脂水平增加会伴随着铁死亡敏感性的增强，这些发现对合理的设计和利用铁死亡靶向药物来治疗疾病有着重要的意义。

Fig1 全基因组CRISPR筛选发现过氧化物酶体成分是导致铁死亡敏感性的重要因素。

为了探究调控铁死亡敏感性的因素，研究人员对铁死亡敏感的肾癌和卵巢癌细胞进行了全基因组CRISPR-Cas9基因筛选。在这两种模型中，均使用了GPX4的抑制剂ML210或RSL3来诱导铁死亡发生。结果显示，这两种筛选模型中都出现了已知的铁死亡调节因子，如ACSL4，说明该筛选体系在鉴定铁死亡调控因子方面具有较高敏感性及稳定性(Fig. 1a)。

    对筛选结果进行进一步分析，研究人员发现在之前未报道的促进铁死亡基因中，过氧化物酶体组分成为富集程度最高的基因簇。在两个筛选体系中出现的过氧化物酶体相关基因包括过氧化物酶体生物发生基因PEX10和PEX3，编码烷基甘油酮磷酸合酶（AGPS）和脂肪酰基辅酶a还原酶1 (FAR1)的基因，以及其他过氧化物酶体相关基因(Fig. 1b)。

由于之前并没有报道过过氧化物酶体参与细胞铁死亡，所以研究者想进一步阐明其在铁死亡过程中可能发挥的作用。在OVCAR-8和786-O细胞中分别敲除PEX3、PEX10或PEX12后发现，其可降低过氧化物酶体的丰度及细胞对GPX4抑制引起的铁死亡的敏感性。说明过氧化物酶体在肾癌和卵巢癌细胞中对铁死亡敏感性具有调控作用(Fig. 1c)。

Fig2多不饱和醚脂生物合成途径介导了过氧化物酶体对铁死亡的促进作用。

在细胞中过氧化物酶体主要发挥解毒胞内活性氧（ROS）分子，及启动长链和支链的脂肪酸降解等功能，除此之外过氧化物酶体还参与醚酯的合成。跟酯键连接的二酰基甘油酯不同，它在甘油的sn-1位置连接了一个醚基(Fig. 2a)。醚磷脂包含两个类型，一个是1-O-烷基-甘油磷脂，另一个组分是1-O-烯基-甘油磷脂，就是被熟知的缩醛磷脂^[5]。大部分缩醛磷脂在sn-2位置会有一个酯键连接的多不饱和脂肪酰基链。通过脂质组学分析，研究人员发现在细胞中敲除PEX3或PEX10，均可选择性降低醚磷脂水平，其中降低最明显是多不饱和醚磷脂(PUFA-ePLs)，且这些磷脂大部分是缩醛磷脂(Fig. 2b)。

    AGPS和FAR1是两种催化醚脂合成的过氧化物酶，由于它们也出现在之前的CRISPR筛选结果中，且处于靠前位置，因此研究者们猜想醚脂合成可能是过氧化物酶体发挥促进铁死亡作用的一个关键因素。在OVCAR-8细胞中敲除AGPS或FAR1基因，均可发现细胞对铁死亡诱导剂ML210的敏感性下降，并且伴随着细胞中醚磷脂水平的降低(Fig. 2c-g)。相反，敲掉与醚磷脂无关的两个过氧化物酶SOD1或 CAT并不会影响细胞对铁死亡的敏感性。

脂质生物合成是通过过氧化物酶体与内质网(ER)的功能协作来实现的。在过氧化物酶体中，酶FAR1、GNPAT和AGPS合成醚脂前体1- o -烷基-甘油-3-磷酸(AGP)，随后AGP被转运到ER，在那里它的甘油sn-2位置上会发生酰基化，头部基团被加到sn-3位置上，另外在合成缩醛磷脂的情况下，其会通过脱氢生成一个双键，即烯烃醚键。虽然在sn-2位置加入PUFA对于铁死亡相关醚脂的合成至关重要，但尚不清楚是哪一种ER酶介导了这一过程。

AGPAT3是编码ER -驻留酶1-酰基甘油-3-磷酸o-酰基转移酶3的基因，研究者们发现其在两个CRISPR筛选中均有出现。且之前有报道AGPAT3可以选择性地将花生四烯酸或二十二碳六烯酸结合到溶血磷脂酸上，从而合成二酰基多不饱和-磷脂酸。然而，AGPAT3是否也参与了AGP的酰化和PUFA-ePL的生物合成尚不清楚。为此，研究人员进行了脂质组学分析，结果显示，敲除AGPAT3可选择性地降低醚磷脂和二酰基磷脂水平(Fig. 2h)。与之前结果一致，AGPAT3的基因缺失可显著降低细胞对铁死亡的敏感性，证实了AGPAT3的促进铁死亡作用(Fig. 2i)。以上结果表明AGPAT3在ER中发挥过氧化物酶体途径下游合成PUFA-ePLs的作用。

Fig3最初依赖GPX4的癌细胞通过下调PUFA-ePL来逃避铁死亡

接下来，研究者对过氧化物酶体在体内是否会促进细胞对铁死亡的敏感性进行了探究。由于缺乏体内使用的GPX4抑制剂，他们构建了GPX4敲除的 OVCAR-8 和 786-O 细胞系，并加入了铁死亡抑制剂Fer-1来维持细胞活性。阴性对照GPX4^−/− sgNC细胞在不加Fer-1的情况下会快速发生铁死亡，而同时敲低PEX3, PEX10, AGPS 或 FAR1则可以提高细胞活率(Fig. 3a)。体内实验结果表现出了与体外实验一致的趋势，说明过氧化物酶体-醚脂质轴在体内体外均可以促进铁死亡敏感性(Fig. 3b)。另外，也有数据表明，单独敲除AGPS, FAR1,PEX3 或 AGPAT3在体内体外均不会影响肿瘤细胞生长，说明醚磷脂对肾癌和卵巢癌的生长并不是必要的，但其富集后会增加铁死亡敏感性。

有趣的是，体内移植瘤结果显示，铁死亡敏感的GPX4^−/− OVCAR-8 和 786-O细胞在最初似乎无法在小鼠体内定植，然而在经过一段长的潜伏期后，其也出现了较大的肿瘤结节(Fig. 3c)。研究人员对新长出的786-O肿瘤组织中癌细胞进行了分离，发现它们仍然是GPX4缺失的(Fig. 3d)。将这些铁死亡抵抗细胞（FR1）再次植瘤，结果发现其可以快速长出肿瘤，而且没有潜伏期(Fig. 3e)。这表明FR1细胞已获得一种或多种细胞遗传性状，从而使其对GPX4缺失不敏感。

为了探究体内实验中发现的铁死亡逃逸的机制，研究者们对从FR1植瘤的肿瘤组织中分离出来的GPX4^−/− FR1 （FR2）细胞进行了代谢组学和脂质组学的分析，结果发现，与亲本细胞相比，PUFA-ePLs是FR2细胞中下调最明显的脂质(Fig. 3f-h)，说明ccRCC细胞可以调节其PUFA-ePL水平，并且这种生化可塑性可能在体内会促进细胞逃避铁死亡。

接着，研究者们评估了是否是由于过氧化物酶体生物合成的缺失导致了PUFA-ePL下调。结果发现与亲本肿瘤细胞相比，FR2细胞中过氧化物酶体的丰度没有明显变化。此外，外显子组测序仅显示FR2细胞中有一个非同义的体细胞突变，即TLR7中的一个小移码缺失，其并没有出现在之前的CRISPR筛选中，并且其也没有与铁死亡相关的报道。然而，RNA测序显示，在87个已知的过氧化物酶体和醚脂质生物合成基因中，AGPS和TMEM189（也称为PEDS1）在FR2细胞中显着下调，并且在蛋白水平上也验证了其表达下降(Fig. 3i,j)。TMEM189编码一种1-O-烷基-PE去饱和酶，该酶可将1-O-烷基醚转化为1-O-烯基醚，并在癌症依赖图谱中显示与ACSL4，PEX3和FAR1具有共依赖性。但是，TMEM189并没有出现在我们的CRISPR筛选结果中。此外，使用CRISPR–Cas9，shRNA或cDNA干扰TMEM189水平不会显着改变细胞对铁死亡的敏感性，这表明PUFA ePL的促铁死亡作用并不依赖于烯基醚中存在的双键。相比之下，我们发现AGPS缺失会下调1-O-烷基-脂质和1-O-烯基-脂质，并可以恢复GPX4-/-肿瘤的生长。 这表明选择性下调高度不饱和的缩醛磷脂水平可能是细胞在在体条件下实现铁死亡逃逸的一种重要途径。

Fig4神经细胞和心肌细胞在分化过程中会上调PUFA-ePLs水平，并增强对铁死亡的敏感性

此外，研究人员又探讨了在非肿瘤环境中，PUFA-ePL是否也具有促进铁死亡作用。他们分别选择了来自大脑和心脏的神经元细胞和心肌细胞作为主要的细胞研究类型。在SH-SY5Y神经元分化模型中，研究者们发现分化的神经细胞比亲代细胞对ML210诱导的铁死亡具有更高的敏感性，这种差异与神经元中PUFA-ePEs和PUFA-ePCs上调有关(Fig. 4a-c)。

研究人员还发现，成熟心肌细胞(MP)比人ips细胞来源的心脏祖细胞(CP)对GPX4抑制更敏感(Fig. 4d)。并且在用ML210处理的心肌细胞中发现了具有类铁死亡形态的细胞死亡，该现象可通过使用铁死亡抑制剂liproxstatin-1或Fer-1而逆转，但不能通过坏死性抑制剂necrostatin-1或凋亡抑制剂z-VAD-FMK来改善。脂质组分析进一步显示，与心脏祖细胞相比，心肌细胞显著上调了PUFA-ePEs和PUFA-ePCs水平(Fig. 4e)。 此外，敲低PEX3或AGPS也可降低心肌细胞对铁死亡的敏感性(Fig. 4f)。综上所述，PUFA-ePLs的选择性上调与神经和心脏谱系细胞对铁死亡敏感性有关(Fig. 4g)。

结语

本篇文章揭示了过氧化物酶体和多不饱和醚磷脂在调节癌症，神经元和心脏疾病中对铁死亡敏感性的重要作用。此外还报道了肾癌和卵巢癌细胞在体内对铁死亡产生获得性抵抗作用的新现象及相关分子机制。这些发现表明，多不饱和醚磷脂在不同细胞中存在高度的可塑性，从而影响细胞对铁死亡的敏感性。提示诱导铁死亡可以作为一种强有力的抗癌策略，而阻断铁死亡则可能有助于预防或减轻其对大脑和心脏的各种损害。此外，这一研究也为我们理解不同类型的脂质代谢与细胞命运的关系具有重要意义。

参考文献

[1] Dixon SJ, Lemberg K M，Lamprecht M R，et al.Ferroptosis: an iron dependent form of non-apoptotic cell death [J]．Cell，2012,149(5) : 1060-1072

[2] Stockwell, B. R. et al. Ferroptosis: a regulated cell death nexus linking metabolism, redox biology, and disease [J]. Cell 171, 273–285 (2017).

[3] Zou, Y. et al. A GPX4-dependent cancer cell state underlies the clear-cell morphology and confers sensitivity to ferroptosis [J]. Nat.Commun.10,1617 (2019).

[4] Yang, W. S. et al. Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4 [J]. Cell 156, 317–331 (2014).

[5] Lodhi, I. J. & Semenkovich, C. F. Peroxisomes: a nexus for lipid metabolism and cellular signaling [J]. Cell Metab. 19, 380–392 (2014).