前言

由于筛查的加强，肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUADs）越来越多地在早期病理阶段被检出。但患者预后仍为中差，需要改进早期治疗策略。解密早期驱动LUADs的事件有助于寻找理想的靶点。之前的研究表明，吸烟会导致广泛的分子（例如KRAS突变）和免疫改变，这些改变在LUADs及其相邻的正常生态系统之间共享，并且与肺癌前病变和LUAD的发生密切相关^[1,2]。然而，这些报导大多数是基于bulk方法，并集中在肿瘤和肺内正常组织的远端部位。因此，LUAD景观的细胞和转录表型仍需扩展。此外，可能由于上皮细胞在肺部单细胞测序分析中的数量缺乏（4%），其亚群的特性，如何促进损伤，触发正常肺（NL）癌前病变和促进LUAD发病仍不清楚。因此，了解肺腺癌发生早期的细胞类型特异性变化有助于确定可采取行动的靶点和策略，以预防这种疾病。

近期王凌华教授团队在Nature上发表的文章“An atlas of epithelial cell states and plasticity in lung adenocarcinoma”研究了来自16例早期肺腺癌和47个对应NL样本中的246,102个上皮细胞。发现上皮细胞具有多种的正常和癌细胞状态，癌细胞之间的多样性与LUAD特异性致癌驱动因子密切相关。其中，KRAS突变（原癌基因）的癌细胞有明显的转录特征，表现为分化减少。而人LUAD样本周围的非恶性区域富集了肺泡过渡细胞（KRT8⁺肺泡过渡细胞，KACs），表现为KRT8表达升高，分化减少，可塑性增加并驱动KRAS突变。同时，研究人员发现KACs的表达谱在在肺癌前细胞和肺腺癌细胞中富集。在暴露于烟草致癌物的小鼠中，KAC出现在肺部肿瘤之前。此外，富含KAC表型、来源于肺泡2型（alveolar type 2, AT2）细胞的类器官可以获得Kras突变，并表达对靶向KRAS抑制的敏感性。AT2的谱系标记细胞或KRT8⁺细胞在致癌物暴露后也表明KACs可能是AT2向肿瘤细胞转化的过渡产物。总之，该研究为LUADs的早期发展提供了上皮细胞状态的新见解，可能成为预防或干预的潜在靶点。

作者介绍

王凌华教授是美国得克萨斯大学安德森癌症中心基因组医学系的终身副教授，胃肠道孢子计划生物统计学和生物信息学的联合主任。王教授目前担任Break Through Cancer支持的胰腺癌和卵巢癌项目的数据科学站点负责人，共同领导得克萨斯大学安德森癌症中心的高危多发性骨髓瘤登月计划。在计算生物学、癌症基因组学和免疫信息学方面拥有丰富的专业知识，她的团队专注于对肿瘤生态系统的深度分析，包括细胞和分子异质性、表型可塑性以及细胞与肿瘤微环境之间的相互作用和计算框架。

研究内容

1.LUAD患者肺上皮细胞转录景观

作者使用scRNA-seq、全外显子测序（WES）、高分辨率空间转录组学（ST）和蛋白质分析研究了16例早期LUAD患者样本和47个对应NL样本中的EPCAM⁺（上皮细胞粘附分子）上皮细胞亚群，这些样本包括肿瘤邻近位置、肿瘤中间位置和肿瘤远处位置^[3]。经过质量控制，保留了246,102个上皮细胞进行分析（Fig.1a）。通过整合染色体拷贝数变异（CNVs）、聚类分布和谱系特异性基因表达等信息将其区分为恶性肿瘤细胞（n=17,064）和正常细胞（n=229,038）（Fig 1b）。有趣的是，恶性肿瘤细胞表现出谱系特异性标志物低表达乃至不表达的特征，表明谱系同一性降低。Fig 1c显示恶性肿瘤细胞形成了14个clusters。基于基因组分析（WES）的注释发现来自3例KRAS^G12D突变的LUAD患者（KM-LUAD）的恶性肿瘤细胞紧密聚集在一起，相比之下，来自其他LUAD的恶性肿瘤细胞表现出更分散的聚集模式（Fig 1c, d）。

2. LUAD恶性细胞的转录程序

PCA数据的三维散点图显示KM-LUADs的恶性细胞聚集在一起，与EGFR突变LUADs（EM-LUADs）或MET突变LUADs（MM-LUADs）的恶性细胞明显不同（Fig 1e）。根据病人特异性特征，将恶性细胞重新分群，显示多数KRAS突变恶性细胞（cluster 5，患者P2、P10和P14）与其他细胞分开聚集，表明KRAS突变细胞中存在不同的转录程序（Fig 1f）。LUAD恶性细胞的分化状态表现出高度的患者间异质性。也就是说，无论肿瘤突变负荷如何，KM-LUAD细胞的分化程度最低，与其最高的CytoTRACE评分相对应，其次是EM-LUAD（Fig 1g, h）。此外，在分化状态下还存在肿瘤内异质性（ITH）（例如，患者P2, P9, P14和P15），其中14例可检测到恶性细胞的患者中有7例的恶性细胞表现出广泛的CytoTRACE评分分布，KM-LUAD比EM-LUAD或其他LUAD表现出更高的分化变异性趋势（Fig 1 h）。总之，LUAD细胞和与KM-LUAD相关的转录程序之间存在广泛的转录组异质性。

Fig.1 Transcriptional landscape of lung epithelial and malignant cells in early-stage LUAD.

3.与KM-LUAD发病相关的肺泡过渡细胞-KACs

在16例LUAD患者中有7例的AT2细胞随着NL样本肿瘤接近度的增加而逐渐减少，而肺泡过渡细胞（AICs）相反。拟时序分析发现，AICs出现在AT2至AT1细胞发育和分化过程中（Fig 2a），这一结果与暴露于急性肺损伤的无癌小鼠的过渡肺泡细胞相似^[4]。并且根据Fig 2a推断，AICs细胞可能为进化成恶性细胞（KRAS突变）的过渡细胞。对AICs的进一步分析发现了KRT8明显高表达的亚群（Fig 2b）。这些KACs还表达CDKN1A、CDKN2A、PLAUR和肿瘤标志物CLDN4，具有分化程度低和发育较晚的特点（Fig 2c）。值得注意的是，KACs更倾向于转变为KRAS突变的恶性细胞，而其他AICs则与AT1细胞的分化密切相关。与多区域NL组织相比，LUADs非恶性上皮细胞中KACs的比例显著增加（Fig 2d），且LUADs中KACs的占比也明显高于AT1、AT2细胞或其他AICs（Fig 2e）。

为了进一步了解KACs的重要表型和特征，通过对多个肿瘤样本进行空间转录组测序（Visium spatial transcriptomics，10X）和数字空间图谱扫描（Digital spatial profiling），研究发现KACs在肿瘤邻近区域（TANs）和恶性细胞旁边被富集（Fig 2f）。值得注意的是，尽管在NL样本中也发现了KACs，但与NL部位的KACs相比，肿瘤附近的KACs簇聚集在离其他AICs更远的地方，表明只有在TANs中它们才表现出“活性”上皮细胞的特征。患者P14肿瘤组织的ST分析显示，KRT8在肿瘤区域（高CNV评分）和由高活性肺细胞组成的TAN区域（中低CNV评分）表达增加（Fig 2g）。同时，KACs标记物（Fig 2b）被发现在肿瘤区域和TAN区域富集，并且它们在空间上与KRAS特征重叠（Fig 2g）。作者选取了一种类似于KRAS，但只在KACs中高表达的KAC信号，独立于AT1, AT2和其他AICs。该标签与KRAS成正相关，与肺泡特征成负相关（Fig 2h）。随着NL、癌前非典型腺瘤性增生（AAH）和侵袭性LUAD的匹配，KAC特征显著且逐渐增加（Fig 2i），而其他AICs没有这种变化。KM-LUADs中的KACs存在KRAS^G12D突变，但仅存在于KM-LUADs组织中（主要为肿瘤区域），因此其在KM-LUADs中的VAF（10%）明显高于在所有检测LUADs（5%）或样本（3%）中的。与此同时，KRASG12D型KACs的KRAS特征也比KRASWT型KACs显著增加。KRAS^WT KACs相对于其他AICs和其他AICs相对于AT2细胞的KRAS信号也增加。这一结果说明在AT2-AICs-KACs的分化过程中，KRAS信号逐渐增加。总之，该研究将KACs描述为与人类LUAD发病机制高度相关的过渡肺泡细胞亚群，特别是KM-LUAD。

Fig.2 Identification and characterization of KACs in human LUAD.

4.KAC细胞状态与小鼠KM-LUAD相关联

为了对一系列关于KACs的科学问题进行系统性的探索，研究人员对肺谱系特异性G蛋白偶联受体a基因Gprc5a（Gprc5a^−/−）敲除的小鼠肺上皮细胞进行了scRNA-seq分析，这些细胞在暴露于烟草致癌物质后容易发生KM-LUADs。作者分析了在接受尼古丁衍生亚硝胺酮（NNK）或生理盐水（对照）处理结束（EOE）和结束后7个月（从KM-LUAD发病时间点开始）的Gprc5a^−/−小鼠的肺部（Fig 3a）。对9272个高质量上皮细胞的聚类分析揭示了许多不同的细胞系，包括聚集在AT1和AT2细胞亚群之间并靠近肿瘤细胞的KACs。恶性细胞仅在NNK处理7个月后出现，在NNK和盐处理EOE时不存在。与对照组相比，在EOE时，KAC数量显著增加，并在NNK处理7个月后，KAC基本保持不变（Fig 3b），说明小鼠KACs出现在KRAS突变型肿瘤出现之前。免疫荧光分析显示，KRT8⁺ AT2来源的细胞存在于NNK暴露的NL中，而在盐处理小鼠的肺部几乎不存在。LUADs也显示KRT8高表达（Fig 3c）。KACs的Kras^G12D突变显著增加，CNV负担加重，与肺泡分化丧失的相关基因（例如Gnk2）的表达增加，但与恶性细胞相比程度还较低（Fig 3d）。NNK治疗7个月后的ST分析显示，肿瘤区域Krt8表达显著增加，并且KAC和KRAS特征在空间上重叠（Fig 3e）。上述结果表明，与人类数据一致，KAC和KRAS特征表达增加的Krt8⁺KACs在肿瘤周围的“反应性”非肿瘤区域中富集，并且是正常细胞向肿瘤细胞转变的中介。

Fig.3 KACs evolve early and before tumour onset during tobacco-associated KM-LUAD pathogenesis.

如肺腺癌患者，小鼠的单细胞RNA测序数据的拟时序分析也提示，KACs可能来源于AT2细胞，是AT2向AT1分化的过渡状态，可向恶性细胞转变（Fig 4a）。作者使用GFP标记AT2细胞的Gprc5a^−/−小鼠（Gprc5a^−/−; Sftpc^creER/+; Rosa^Sun1GFP/+），来验证小鼠KACs是否来源于AT2细胞（Fig 4b）。免疫荧光显示GFP⁺细胞（n = 3,089）几乎完全由AT2、早期肿瘤和AT2样肿瘤细胞、KACs和KAC样细胞和少量AT1细胞组成，所有这些细胞在GFP^-部分中几乎不存在。与盐处理小鼠相比，NNK处理3个月后小鼠的GFP⁺AT1细胞、KACs和肿瘤细胞的比例明显增加（Fig 4c）。同时，利用GFP标记的AT2细胞培养的类器官也显示NNK处理3个月后，报告小鼠的GFP类器官与对照组相比，生长明显增强，并且几乎完全由具有KAC特征的细胞组成（KRT8, CLDN4）。为了进一步证实KACs可以产生肿瘤细胞，作者利用Gprc5a^−/−; Krt8-creER; Rosa^tdT/+谱系追踪小鼠标记了KRT8⁺细胞，分析了来自NNK暴露结束（EOE），NNK暴露后8至12周NL和肿瘤的样本。证实了与对照盐处理小鼠相比，tdT标记（KACs数量）会在EOE至NNK时的肺实质中增加（Fig 4d）。其中，一部分肿瘤细胞显示出强烈的tdT标记，表明KRT8⁺细胞发生癌变。免疫荧光计数结果分析显示，大多数tdT⁺肿瘤细胞是AT2细胞衍生的（LAMP3⁺）。而在EOE和EOE后对NNK的跟踪显示，tdT⁺ LAMP3⁺细胞占总tdT细胞的比例几乎不变（Fig 4e）。综上所述，体内分析确定KACs是KM-LUAD早期发展和烟草致癌物质暴露后的过渡细胞状态。

Fig. 4: KACs are implicated in the transition of AT2 to Kras mutant tumour cells.

结论

本研究对来自早期LUADs和外周肺上皮细胞的多模态分析揭示了与KM-LUAD发病机制相关的多种恶性上皮细胞状态、肿瘤内异质性模式和细胞可塑性程序。其中，作者鉴定了肺泡分化程序激活后出现的肺泡过渡细胞（KACs）可以作为KM-LUAD的前期细胞，并与KRAS突变肺肿瘤细胞之间具有紧密联系和密切共享的特性（Fig 4f）。KACs特定属性和状态的发现可能为肺腺癌的预防和早期干预提供潜在的研究靶点。

参考文献

1. Kadara, H., Scheet, P., Wistuba, I. I. & Spira, A. E. Early events in the molecular pathogenesis of lung cancer. Cancer Prev. Res. 9, 518–527 (2016).

2. Spira, A. et al. Airway epithelial gene expression in the diagnostic evaluation of smokers with suspect lung cancer. Nat. Med. 13, 361–366 (2007).

3. Sinjab, A. et al. Resolving the spatial and cellular architecture of lung adenocarcinoma by multiregion single-cell sequencing. Cancer Discov. 11, 2506–2523 (2021).

4. Treutlein, B. et al. Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq. Nature 509, 371–375 (2014).